DNA的提取与验证

2015-06-29 08:01:34   来源：   撰稿：李黎丹   摄影摄像：    ;  评论：0 点击：

                             DNA的提取与验证

组长：高一6王新然

成员：高一6王新然 路可欣 孙艺天 石可欣 周俊怡 马嘉欣 陈宣伊 左露露

   小时候，看着形形色色的人，我总会想：为什么他们长得不一样，这么多人呢，除了双胞胎总该有一样的吧。渐渐大了，知道有DNA的存在，它让每个人都不一样，就想这是多么神奇的生气的东西，能不能拿出来看一看。这次的的综合性学习，给了我们小组每个人一个机会，进行探索与实验。

   实验开始前，我们准备了新鲜鸡血作为实验材料，通过查阅资料得知取材不可用植物细胞，因有细胞壁，难以破裂释出核物质；也不可用哺乳动物的血细胞，因哺乳动物的成熟红细胞无细胞核和细胞器，故DNA极少。我们从老师那要来了消化缓冲液，液氮或少许石英砂，Tirs饱和酚，Cl液，离子水等试剂和1.5ml离心管，移液枪，大小烧杯，试管，离心机，试管架，小量筒等专业用具。开始前，我们还需制备鸡血细胞液，在制备时还加入柠檬酸钠（抗凝剂），使血液分层，取下层血细胞。为了获取DNA时要向鸡血细胞液加入足量的蒸馏水，以便使细胞膜和核膜破裂，核内物质释放出来。一切准备做好后，便开始动手做试验了。

  首先，一号同学负责研磨。只见他取样少许置入1.5ml离心管中，以移液枪加入消化缓冲液600μl，而后冲入液氮或少许石英砂研磨至澄清。接着，他便开始水浴加热，水浴温度55℃，水浴时间3-5h左右。经过漫长的等待，我们开始进行下一步——酚抽提。二号同学向每支离心管中加入600μl Tris饱和酚，轻柔的摇晃使固液混合充分，然后放入离心机，将离心机的温度控制在4℃左右，8000r/min，离心10min后，以移液枪小心的将上清液取出至新管，重复步骤一次。完成后，三号同学开始了Cl抽提：向抽提出的上清液中加入等体积的Cl液，轻柔的摇晃使充分混匀，均匀后放入高速冷冻离心机，温度以仍然设在4℃，将8000r/min加速为10000r/min，离心10min后，以液枪小心的将上清液取出。DNA沉淀这一步是由四号同学做的。他向抽提的上清液中加入2倍体积的无水乙醇，并轻柔的摇晃使溶液充分，再置于-20℃冰箱中保存10min后再放入高速冷冻离心机，4℃，12000r/min，离心5min后，他小心倾去乙醇，我们便看见了DNA沉淀物。DNA 洗涤这一步是由细心的五号同学做的。他向在留有DNA沉淀物的离心管中加入原先在-20℃冰箱中保存的70%乙醇500μl，后放入离心机，4℃，12000r/min，离心5min，小心倾去乙醇后便看见离心管底白色小圆片状的DNA提取物。然后他将离心管倒置于无菌室内室温至干燥。最后一步DNA溶解，六号同学向干燥好的DNA提取物中加入30μl去离子水，放入4℃冰箱保存。保存完成后，我们便看到了大家齐心协力，共同提取出的DNA。完成DNA的提取后，便开始对DNA验证。七号同学向我们提取的DNA中加入二苯胺后沸水加热5分钟，待试管冷却后观察到溶液颜色有所变化，成了蓝色；然后向另一份DNA提取物中加入甲基绿，只见颜色又变成了绿色。至此，我们终于明白了科学家是

如何的艰辛才能观察到一团DNA了。

  在这次的实验中也有诸多细节然我们注意，我在此做一下说明：实验中共三次过滤，过滤时使用的纱布层数与取其滤液或粘稠物有关，第1、3次要用其滤液，使用的纱布为2层，第2次是要用其滤出的粘稠物，使用的纱布为多层；实验中有6次搅拌，除最后一次搅拌外，前5次搅拌均要朝一个方向，并且，在析出DNA、DNA再溶解和提取中，各步搅拌都要轻缓，玻璃棒不能直插烧杯底部，以防止DNA分子断裂；有2次加蒸馏水，一次是在第一步，加水是为了使血细胞吸水膨胀破裂，加水后必须充分搅拌，使血细胞充分破裂，第二次加蒸馏水是在第三步，是为了稀释氯化钠溶液；有3次加氯化钠溶液，在第二步中，加氯化钠后，必须充分晃动烧杯，使二者混合均匀，加速染色质中 DNA与蛋白质分离，使DNA充分游离并溶解在氯化钠溶液中，在第五步中，加氯化钠溶液也是为了DNA的再溶解，这时溶液中的蛋白质含量已很少，在第八步中，加的氯化钠溶液的浓度比前2次低得多，但还是为溶解DNA；在最后的DNA溶解时，必须使用冷酒精（至少在5度下存放24小时，对DNA凝集效果较佳），如果悬浮在溶液中的DNA丝状物较少，可将混合液放入冰箱中再冷冻几分钟。

在实验器具上，也有些地方值得关注，比如：因为DNA易吸附在玻璃容器上，所以实验中最好使用塑料烧杯和试管，以减少DNA的损失。盛放鸡血细胞液的容器最好也是塑料的，等等。

  我们做的是精提取DNA，除此之外，还做了DNA的粗提取与鉴定。

  我们选用新鲜菜花为实验材料，实验道具有：塑料烧杯、量筒、玻璃棒，尼龙纱布、陶瓷研钵、试管、试管架、试管夹、漏斗、酒精灯、石棉网、三脚架、火柴、刀片、天平，研磨液：体积分数为95%的酒精溶液，二苯胺试剂，蒸馏水。然后，便开始了实验：

（1）准备材料：将新鲜菜花和体积分数为95%的酒精溶液放入冰箱冷冻室，至少24小时。 

（2）取材：称取30 g菜花，去梗取花，切碎。

（3）研磨：将碎菜花放入研钵中，倒入10 mL研磨液，充分研磨10 min。 

（4）过滤：在漏斗中垫上尼龙纱布，将菜花研磨液滤入烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。 

（5）加冷酒精：将一倍体积的上清液倒入两倍体积的体积分数为95%的酒精溶液中，并且玻璃棒缓缓地轻轻搅拌溶液（玻璃棒不要直插烧杯底部）。沉淀3~5 min后，可见白色的DNA絮状物出现。用玻璃棒缓缓旋转，絮状物会缠在玻璃棒上。

（6）取含DNA的黏稠物放入桡杯内，加入2mol/L的NaCl溶液40mL，用玻璃棒沿一个方向不停搅拌3min，使黏稠物尽可能多地溶解。

（7） 用两层纱布过滤含 DNA的氯化钠溶液，取其滤液。

（8）在滤液中加入冷却的无水乙醇，并用玻璃棒沿一个方向轻轻搅拌，由于 DNA不溶于酒精，会出现乳白色丝状物，用玻璃棒将丝状物卷起，并用滤纸吸去表面的水分。

   提取好DNA后，便开始鉴定：两支试管中各加入0.015mol/L的NaCl溶液5mL，将丝状物放入其中一支试管 中，搅拌使其充分溶解后，向两支试管中分别加入4mL 二苯胺试剂，混匀后沸水溶中加热5min，待试管冷却后，比较两试管的颜色变化，将发现加入DNA的试管中的溶液呈蓝色，从而鉴定DNA的存在。

  这次的实验材料是以植物为材料，虽成功了但干扰较大，于是，我们又按照书本上的内容开始简单的粗提取与鉴定。

  选用鸡血细胞。

1．材料制备 0.1G/ml柠檬酸钠100ml500ml烧杯→玻璃棒搅拌→1000r/min离心2min→吸去上清液→活鸡血180ml             

 即得鸡血细胞液（也可将上述烧杯置于冰箱中，静置天使鸡血细胞自行沉淀）

 2．方法步骤： 取血细胞液5-10ml＋20ml蒸馏水，玻璃棒沿一个方向快速搅拌

 （1）提取血细胞核物质   纱布过滤，滤液中含DNA和其他核物质，如蛋白质。 原理：血细胞的细胞膜、核膜吸水胀破，玻璃棒快速搅拌机械加速血细胞破裂

（2）溶解核内DNA：滤液＋2mol/LNaCl溶液40ml，玻璃棒沿一个方向搅拌  

（3）析出含DNA的粘稠物：向上述溶液中缓缓加入蒸馏水，并轻轻地沿一个方向搅拌，出现丝状物，当丝状物不再增加时，停止加水（此时NaCl溶液相当于稀释到0．14mol/L） 

（4）滤取含DNA的粘稠物：用多层纱布过滤，含DNA的粘稠物留在纱布上 

（5）（纱布上的）DNA粘稠物再溶解：20ml2mol/LNaCl溶液50ml烧杯，上述粘稠物缓慢搅拌3 min

（6）过滤含DNA的2mol/LNaCl溶液：用2层纱布过滤，滤液中含DNA  

（7）提取含杂质较少的DNA：上述溶液＋95%酒精，缓慢搅拌，出现乳白色丝状物，用玻璃棒将丝装物卷起。

  本实验成功的关键是获取较纯净的DNA，因此应注意： 

1．充分搅拌鸡血细胞液。DNA存在于鸡血细胞核中。将鸡血细胞与蒸馏水混合以后，应用玻璃棒沿一个方向快速搅拌，使血细胞加速破裂，并释放出DNA 

2．沉淀DNA必须用冷酒精。实验前必须准备好大量95%的酒精，并在冰箱中（5℃以下）至少存放24小时。

  在提取过程中，还有些问题要注意：

在DNA的鉴定中，所用的二苯胺是一种有毒性的试剂，在使用时注意不要让药液接触到皮肤或身体的其他部位，也不要近距离观察。
加蒸馏水让细胞内溶液的浓度大于周围溶液的浓度，细胞会吸水以至胀破
用力搅拌可以加速血细胞和细胞核的破裂
加蒸馏水的方法和使用玻璃棒，千万不能太快太猛，防止打碎DNA。
加入冷酒精时动作要慢。
当玻璃棒上出现丝状物缠绕时，继续慢慢搅拌。至不再增加时，取出吸干上面的水分。丝状物呈黄色　　
这些丝状物要用二苯胺鉴定。 　  　
加蒸馏水是使NaCl溶液的浓度逐渐降至0．14mol／L，使DNA的黏稠物析出。
DNA不溶于冷酒精，而其他物质可以溶解在酒精中，使含杂质较少的DNA丝状物可以析出。悬浮于溶液中。
从水浴锅中拿出试管，比较两个试管中溶液的颜色有丝状物的试管变成蓝色，另一试管还是原来颜色。说明提取出的丝状物是DNA。
看到的丝状物的粗细不是DNA分子的直径，DNA分子直径只有2nm。丝状物是多个DNA分子聚在一起形成的。

  其实，鉴定DNA的其他方法，用紫外灯照射法鉴定DNA效果很好。具体鉴定方法如下：

1.配制染色剂。用蒸馏水配制万分之五的溴化乙锭(EB)溶液。 

2.将玻璃棒上缠绕的白色絮状物抹于蜡纸上,再滴1滴EB溶液染色。 

 3.将蜡纸放在紫外灯(260 nm)下照射(暗室中),可见橙红色的萤光(DNA的紫外吸收高峰在280 nm处)。 

 实验做完了，很累却很幸福。我们用自己的双手，一步一步的做，最终得到结果。在这期间，我们也许有过烦恼，有过迷茫，有过矛盾，但我们从未缺失过信心，也从未失去团结。一个小小的实验，也让我们体会到了科学的神秘，生物的神秘，更激起了年经的我们对科学的向往。我们期待，有朝一日，能用自己的双

手探索新的奥秘，用自己的双眼，来见证奇迹。